1、新鮮組織樣本包埋

目前新鮮組織的包埋方法有兩種，一種是液氮 + 異戊烷法；另一種的干冰法。對于臨床手術切下來的組織樣本一般使用干冰的包埋方法。對于穿刺樣本等一些較小，較輕的樣本，一般推薦用液氮 + 異戊烷的方法進行冷凍。OCT 包埋組織塊可以在–80oC 的密封容器中長期保存，或立即進行冷凍切片。

2、冷凍切片切、組織樣本質控及貼片

由于空間轉錄組檢測的是組織中的 RNA，因此要對切片中的 RNA 質量進行檢測。我們一般取 10 片組織切片進行 RNA 抽提并質檢，確定組織中 RNA 完整性（RIN>7）。所以要求我們的組織樣本要保證可以切到至少 20 片 10um 厚度的切片，以便完成所有的實驗。

3、組織優化

組織優化的目的是摸索樣本的透化條件，保證組織切片中的 mRNA 能夠充分釋放。該步驟是獲取真實實驗結果的必要條件。否則，我們無法判斷是基因表達高低到底是因為透化不充分導致的，還是實際就是這個樣子。因此：每個樣本建議都要做透化，尤其是臨床樣本。

4、成像

應使用 Visium Imaging Test Slide 驗證成像設置。明場成像基準框和基準標記應清晰可見，并使用 Brightfeld 設置聚焦。Visium Imaging Test Slide 四個區域（A1，B2，C1，D2）具有熒光斑點，可通過 TRITC 和 Cy5 flter cubes 檢測到，熒光設置應清晰可見 A1，B2，C1 和 D2 中的熒光點，且熒光點信號應從左到右減小。

5、正式實驗

正式實驗時要對反轉錄后的 cDNA 長度分布，濃度和量進行判斷。cDNA 的長度分布在~200bp-9000bp 之間，在 1000bp 左右會有峰值（不同的組織類型會有些許差異）。

6、測序

在捕獲區域，每個組織覆蓋的 spot 建議至少測 50000 read pairs。整個捕獲區域共有 5000 個 spots。可以根據組織貼到芯片上后，覆蓋芯片的大小來判斷測序的數據量。

計算公式（Coverage Area x total spots on the Capture Area)x 50,000 read pairs/spot 例如：組織覆蓋了 60% 的區域，則數據量為（0.60 x 5,000 total spots) x 50,000 read pairs/spot=150 million read pairs。