【文章題目】Opposing Wnt signals regulate cervical squamocolumnar homeostasis andemergence of metaplasia

【雜志名稱】Nature Cell Biology(IF=17.73)

【發表時間】2021 年 1 月 18 日

【主要技術】10XGenomics

主要結果

鱗狀上皮和柱狀上皮細胞來源不同

宮頸連接宮腔和陰道，由宮頸外和宮頸內兩部分組成。宮頸內壁的柱狀上皮與子宮腔相鄰，由內口隔開，而宮頸外的鱗狀上皮伸向陰道。外口標志著從宮頸外到宮頸內的過渡，在那里柱狀上皮與鱗狀上皮相遇，形成鱗狀柱狀上皮交界處（SCJ)(圖 1)。

▲圖 1   小鼠（Mm）和人（Hs）女性生殖道（FGT）的示意圖

作者對健康小鼠的宮頸內膜、宮頸外和過渡區這 3 個組織區域進行 ScRNA-seq 和聚類分析，根據細胞特異性的 marker 基因將亞群分成 7 種類型：基質細胞（Stromal)，平滑肌細胞（SMC)，周細胞（Pericytes)，神經細胞（Neural)，免疫細胞（Immune)，上皮細胞（Epithelial)，內皮細胞（Endothelia)(圖 2b,c)。

聚類結果發現宮頸內的細胞類型與過渡區的細胞類型相似，但宮頸外的上皮細胞（Epithelial)、基質細胞（Stromal)、免疫細胞（Immune) 和平滑肌細胞（SMC) 亞群顯示出不同的轉錄譜（圖 2a）。

▲圖 2   健康小鼠的宮頸內膜、宮頸外和過渡區組織的 scRNA-seq 結果  

對上皮細胞群體進行重新聚類，揭示了兩種主要的上皮細胞類型：Krt5hi/Krt14hi 鱗狀細胞（SQ) 和 Krt8hi/Krt19hi 柱狀細胞（Co)。這些進一步被分為六個轉錄上不同的亞群（SQ1、Sq2A、Sq2B、SQ3、CO1 和 CO2)，其中將肌上皮細胞（Me) 歸類為 Krt5hi/Krt14hi 亞群，它與 KRT5+ 細胞和肌成纖維細胞有相同的基因表達譜。同時也表達成纖維細胞 marker 即 Col6a2。這些細胞可能是鱗狀細胞系的候選前體（圖 3)。

▲圖 3   健康小鼠的宮頸內膜、宮頸外和過渡區組織上皮細胞細分結果

SQ1 亞群含絲分裂相關基因，表達 Trp63、Birc5、Mki67、Cks2 和 Hmgb2，表明復層宮頸的基底干細胞。Sq2A 和 Sq2B 亞群含皮膚發育和應激或損傷反應基因，并表達 Trp63、Krt15、Dkk3 和 Notch1。SQ3 亞群含角質形成細胞分化和皮膚發育基因，表達 Fam25c、Gm94、Krt6a 和 Krt10，表明鱗狀細胞分化。

CO1 亞群含分支上皮形態發生和脂質分解過程相關基因，表達 Anpep、Cxcl17、Krt8 和 Krt18。CO2 亞群含應激反應、細胞凋亡和對未折疊蛋白的反應基因，并表達 Krt19、Ltf、Muc1 和 Psca(圖 3)。

▲圖 3   上皮細胞亞群的相關 GO 富集結果

熒光免疫組織化學和 smRNA-ISH 證實 KRT5 和 KRT8 分別標記了整個鱗狀分層和柱狀上皮細胞。作者通過 Krt5-CreERT2；Rosa26-tdTomato 和 Krt8-CreERT2；Rosa26-tdTomato 小鼠進行譜系追蹤，Krt5+ 細胞僅標記復層上皮，而 Krt8+ 細胞僅標記宮頸內上皮。兩種上皮在過渡區融合，而 Krt5+ 鱗狀細胞似乎取代了覆蓋 Krt8+ 的柱狀細胞。結果表明這兩種上皮細胞類型來自兩個不同的譜系（圖 4）。

▲圖 4   宮頸的鱗狀和柱狀譜系以及過渡區的示意圖

過渡區的上皮邊界由不同的基質 Wnt 信號界定

作者通過類器官模型來確認維持這兩種上皮細胞的干細胞微環境是不同的。在 Wnt- 的培養基（不含 Wnt3a 和 Rspo1) 中培養的宮頸內膜上皮細胞產生 P63+，Krt5+ 復層的類器官，類似于宮頸外類器官。源自宮頸外的細胞僅產生鱗狀類器官，說明與 Wnt 無關。而柱狀類器官的形成是依賴于 Wnt 的，與鱗狀類器官的形成不同。類器官的 Microarray 分析表明，Wnt 在宮頸內細胞和宮頸外細胞中的轉錄調控有所不同：Wnt 激動劑在柱狀上皮中上調，而 Wnt 拮抗劑 Dkk1 和 KREMEN1 在鱗狀上皮中上調（圖 5)。

▲圖 5   人宮頸外與宮頸內類器官差異調控基因的表達分析

為了深入了解基質如何影響這兩種不同的宮頸上皮的動態平衡，作者結合 scRNA-seq 數據的聚類分析揭示了基質細胞群的五個轉錄上不同的亞群。S1，S2 和 S3 亞群代表宮頸內膜移行區的細胞，通常表達 Hes1，Nfkbia 和 Egr1。S2 亞群高表達 Wnt16 和 Axin2，S3 亞群高表達 Mmp3，Adh1，Ces1d，Cxcl16，Rspo1 和 Rspo3。亞群 S4A 和 S4B 代表宮頸基質細胞；亞群 S4A 顯示 Sfrp1 和 Bmp4 的優先表達，亞群 S4B 表達 Dkk2 和 Crabp1。smRNA-ISH 分析也證實了 scRNA-seq 數據（圖 6)。

▲圖 6   健康小鼠的宮頸內膜、宮頸外和過渡區組織基質細胞的重新聚類結果

為了進一步研究 DKK2 和 DKK3 的作用，作者將宮頸內膜類器官重新接種在含有 WNT3A 和 RSPO1 加 DKK2/DKK3/DKK2 和 DKK3 的培養基中。將 Wnt 缺乏的培養基用作對照。DKK2 的存在導致柱狀類器官大小的顯著減少，類似于在 Wnt 缺乏的培養基中發現的那樣，這證實 DKK2 發揮了抑制作用。當培養基中還含有 DKK3 時，可以避免這種情況。DKK3 要么對 Wnt 信號沒有影響，要么作為 Wnt 激動劑發揮作用。用 Wnt 抑制劑 2(IWP2) 阻斷 Wnt 信號，抑制宮頸內類器官生長，但不影響宮頸外類器官。這表明鱗狀上皮不依賴于細胞自主的 Wnt 信號。

▲圖 7   人宮頸內膜柱狀類器官和宮頸外復層類器官大小

用 DKK2 或 IWP2 處理后，柱狀和鱗狀類器官中譜系特異性標記 KRT5，KRT8 和 p63 的表達沒有差異?？傊?，這些數據表明宮頸的上皮由兩個不同的干細胞群體維持，它們的命運由相反的 Wnt 信號微環境決定，在過渡區具有明確的開關（圖 8）。

▲圖 8   過渡區不同上皮譜系和組織微環境的示意圖

WNT 拮抗劑、Notch 和 EGFR 信號通路維持宮頸外干性和分化

基因芯片分析顯示，Notch 相關基因在宮頸外鱗狀類器官中的表達高于在宮頸內柱狀類器官中的表達（圖 9)。

▲圖 9   人宮頸外和宮頸內類器官差異基因熱圖

作者通過對 2D 生長的宮頸外胚層細胞（2D-ECTO)、三天大的早期類器官（EO-ECTO) 和兩周大的成熟類器官（DO-ECTO) 進行比較分析來確認分化的機制。結果表明 2D-ECTO 和 EO-ECTO 的基因表達譜具有很高的相似性，但與 DO-ECTO 相比有著明顯差異（圖 10e)。同樣的，2D-ECTO 和 EO-ECTO 與干細胞 marker 的基因集中的表達譜有很高的相似性，但成熟的 DO-ECTO 則不同（圖 10f)，這說明 2D-ECTO 和 EO-ECTO 的細胞對應于宮頸外干細胞。對宮頸外干細胞相對于分化細胞上調的基因的調查顯示，Notch 配體 DLL3 和 MFNG 高表達。而分化的細胞高表達 NOTCH2 和 NOTCH3 受體及其靶點，包括轉錄因子 HES1 和 γ 分泌酶的核心成分 PSEN1。宮頸外干細胞也表達 Dkk1 及其受體 KREMEN2(圖 10g)。因此，使用 γ - 分泌酶抑制劑 DBZ 阻斷 Notch 激活會抑制類器官的生長，無法分化和分層。由此表明宮頸干細胞充當 Notch 信號的來源，而分化細胞充當 Notch 信號的接收細胞，其是促進分化和上皮分層的反式激活相互作用。

▲圖 10  2D-ECTO、EO-ECTO、DO-ECTO 差異基因熱圖

GSEA 富集顯示，受 Notch 下游轉錄因子和 EGFR-Ras-MAPK 信號轉導調控的基因在宮頸外干細胞中高度富集，包括轉錄因子 AP1、CREB、ETS、NERF、ELK1、E2F、SRF、MYC 和 YY134-37(圖 11)。這兩條途徑共同調節增殖和分化，與表皮生長因子在層狀類器官形成中的重要作用一致。相反，屬于 RAS 拮抗的 NF1 通路的基因在分化細胞中富集。這些發現表明，Wnt 拮抗劑與 EGFR 和 Notch 誘導通路共同調節宮頸外干性和分化。

▲圖 10 GSEA 富集共有轉錄因子的順式調控 motifs 相關基因熱圖

基質區室的重塑導致 Krt5+ 鱗狀化生的出現

為了研究與宮頸外鱗狀上皮的干性和分化有關的信號通路和細胞類型在鱗狀化生中的作用。作者將人子宮內膜來源的柱狀細胞放在 Wnt+ 的培養基中培養時，會產生少量的 Krt5+ 或 p63+ 細胞，同樣培養基轉移到類器官條件下會產生柱狀類器官；然而在 Wnt- 的培養基中培養時，出現對 Krt5+ 和 p63+ 細胞的顯著富集的情況，在轉移到類器官條件下，即使在 Wnt3a 和（或）Rspo1 存在的情況下，這些細胞也只產生鱗狀類器官。相比之下，之初 Wnt+ 或 Wnt- 的培養基中生長的人宮頸外細胞，在轉移到 Wnt- 的培養基后只產生鱗狀類器官。這表明子宮內膜中存在鱗狀干細胞，在適當的微環境下可以產生 Krt5+p63+ 細胞。

作者通過誘導 Krt5-CreERT2；Rosa26-tdTomato 和 Krt8-CreERT2；Rosa26-tdTomato 小鼠的譜系追蹤證實了柱狀上皮和復層宮頸上皮來自兩個不同的譜系，每一個譜系都對特定的微環境做出反應。改變 Wnt 信號不會誘導柱狀細胞向層狀細胞的轉分化，反之亦然。

為了分析體內的化生發展，研究人員利用了缺乏維生素 A 的飲食喂養的小鼠的模型，在該模型中，鱗狀化生的異常病灶出現在子宮內膜。為了確定上皮和基質的變化，他們對從宮頸內、宮頸外、過渡區和宮頸內化生（即化生灶）分離的細胞進行了 scRNA-seq 和聚類分析（圖 11）。

圖 11  健康小鼠宮頸外，宮頸內，過渡區和 VA 缺乏引起的鱗狀化生的 scRNA-seq

上皮群體被細分成 Sq，Co 和 Me 亞群，根據每個上皮亞群的表達譜生成的系統發育樹顯示：鱗狀細胞亞群（SQ1、Sq2A、Sq2B 和 SQ3) 和 Me 細胞（Me) 在轉錄上相似，但與柱狀亞群（CO1 和 CO2) 不同。Sankey 圖是用來分析每個組織區域的上皮細胞對不同亞群的轉錄貢獻，結果表明與健康的宮頸內膜上皮相比，宮頸內膜化生表現出與鱗狀上皮和肌上皮型相似的表達譜的擴增（圖 12)。

▲圖 12  上皮亞群的表達譜生成的系統發育樹和 Sankey 圖

作者通過對宮頸內、宮頸外、移行區和宮頸內化生的基質細胞進行重新聚類來描述基質細胞亞群的變化（圖 13a)。宮頸上皮內化生的基質部分與健康的宮頸內、宮頸外和移行區的基質細胞有明顯的差異（圖 13b)。，Sankey 圖同樣表明了宮頸內化生（S2B、S2C 和 S2D) 中出現了與健康宮頸以及外宮頸不同的基質細胞亞群（圖 13c)。作者還觀察到 Dkk2 在宮頸內化生的一個亞群中表達增加，這主要對應于健康小鼠的宮頸外 S4B。這些數據表明，在化生發育過程中，基質發生了廣泛的改建（圖 13e）。

▲圖 13  健康小鼠宮頸外，宮頸內，過渡區和 VA 缺乏引起的鱗狀化生基質細胞 t -SNE 和 Sankey 圖

宮頸癌 SCC 和 ADC 的基因表達模式與鱗狀和柱狀器官特征相關

成體干細胞易轉化，通常構成各種癌癥的起源細胞。到目前為止，尚不清楚 ADC 和 SCC 起源于哪種細胞類型。作者根據鱗狀和柱狀宮頸類器官的基因表達特征來確定宮頸癌起源的可能細胞。TCGA 中的基因表達數據將宮頸癌分為 ADC 和高角蛋白 SCC 組和低角蛋白 SCC 組，其中低角蛋白 SCC 組顯示鱗狀上皮特異性標記物的較低表達。作者根據宮頸外鱗狀上皮和宮頸內柱狀上皮之間差異表達的基因，將癌癥樣本分為鱗狀上皮樣和柱狀上皮樣。結果發現分類為柱狀樣或鱗狀樣的癌癥與分類為 ADC 或 SCC 的組織學分類之間存在一致性；這從與 ADC 或角蛋白高和角蛋白低組的 TCGA 簇的比較中也是明顯的。

其中一組腫瘤含量低，與宮頸外或宮頸內征象無明顯相似性的病例被分類為未確定病例。然而，在 62 例未確定的病例中，有 59 例落在 TCGA 定義的角蛋白低或高角蛋白的鱗狀細胞癌叢中。值得注意的是被歸類為柱狀的癌癥樣本主要是 KRT5low、KRT7high 和 TP63low，而被歸類為鱗狀和未確定的癌癥樣本主要是 KRT5high 和 TP63high，并混有的 KRT7。這表明未確定的組可能由宮頸內或從宮頸內長出的 SCC 組成，導致樣本中存在污染的 KRT7+ 宮頸柱狀細胞。

研究表明位于過渡區的 SCJ 細胞表達 KRT7、CD63、GDA、AGR2 和 MMP7，這些細胞是 SCC 和 ADC19 的前體細胞。因此作者研究了類器官和 TCGA 宮頸癌樣本中的基因表達水平，檢測了 SCJ 標記物 Krt5。這些標記物在宮頸內類器官和 ADC 中的表達明顯高于在宮頸外類器官和鱗癌中的表達，而 Krt5 的表達趨勢則相反。人和小鼠宮頸組織切片的免疫組織化學和 smRNA-ISH 證實 Krt5 在整個鱗狀上皮中均有表達。KRT7 在整個柱狀上皮中表達，在較小程度上在鱗狀上皮中表達，而不是僅限于過渡區。宮頸外類器官對鱗狀上皮標記 Krt5 和 CTSA 呈陽性反應，而宮頸內類器官對柱狀上皮標記 KRT7、AGR2、GDA 和 Kr18 呈陽性反應。這意味著已報道的 SCJ 細胞與宮頸柱狀細胞譜系沒有區別，也不是 SCC 的起源細胞。

與角蛋白高和角蛋白低的鱗狀細胞癌均起源于鱗狀細胞系的觀點一致，該研究還揭示了高角蛋白和低角蛋白的鱗狀細胞癌和 ADC 組之間的差異表達基因。作者在柱狀癌和鱗狀癌（包括 MUC5B、KRT5 和 CSTA) 中觀察到雙模式基因表達，它們將 ADC 與 SCC 區分開來。SCJ 的標記物 KRT7、AGR2 和 GDA 只標記 ADC，而不標記 SCC。綜上所述，大多數宮頸癌可以根據分子特征分為兩組：SCC 可能起源于宮頸外的 Krt5+ 鱗狀譜系，而 ADC 可能起源于宮頸內的 KRT7+KRT8+ 柱狀譜系（圖 14）。

▲圖 14  宮頸癌 SCC 和 ADC 的轉錄特征與鱗狀和柱狀上皮譜系相關

總結

綜上所述，作者的數據表明宮頸鱗狀上皮和柱狀上皮起源于兩種不同的譜系特異性干細胞類型，并確定了這些譜系的亞群。此外，宮頸內外有不同的基質亞群，構成了維持過渡區的微環境梯度。通過信號梯度調節干細胞的維持、分化和組織構型是發育過程中的普遍原則，其中 Wnt 信號是不可或缺的。在基質中存在 Wnt 梯度，它選擇性地驅動柱狀譜系，同時對同一組織中存在的鱗狀譜系特異性干細胞施加靜止。在鱗狀化生中，宮頸內基質經歷了廣泛的改建。作者還觀察到 Wnt 抑制劑 DKK2 在基質亞群中上調。這種向 Wnt 抑制微環境的轉變可能激活靜止的鱗狀上皮干細胞，這些干細胞侵入移行區的柱狀上皮或作為子宮內膜內的化生灶（圖 15)。從分子和細胞的角度來看，目前對維持宮頸上皮連接的機制的闡明提供了一個重要的概念進展。這表明，這些部位的動態平衡并不是通過一種上皮細胞類型向另一種上皮細胞類型的轉分化來維持的。取而代之的是，成體組織類似于不同譜系特異性干細胞群體的整合，由微環境對外部或內部信號做出反應而激活。粘膜過渡區動態平衡的這一概念與對粘膜干細胞鑒定的其他觀察結果非常吻合，并為將來在其他具有高度臨床意義的組織中研究過渡區動態平衡提供了基礎。

▲圖 15  移行區和鱗狀化生期間的兩種上皮譜系和 Wnt-Notch 微環境

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