標(biāo)題：Single-Cell?Analyses?Identify?Brain?Mural?Cells?Expressing?CD19?as?Potential?Off-Tumor?Targets?for?CAR-T?Immunotherapies

期刊：?Cell

影響因子：36.13

導(dǎo)讀

CD19 導(dǎo)向的免疫療法在臨床上對治療 B 細胞惡性腫瘤有效，但也會引起高發(fā)生率的神經(jīng)毒性。使用嵌合抗原受體（CAR)?T 細胞或雙特異性 T 細胞受體（BiTE) 抗體治療的患者部分伴有嚴(yán)重的神經(jīng)毒性，包括與 T 細胞滲入大腦致命的腦水腫。在這里，作者報道了包圍內(nèi)皮細胞的壁細胞表達 CD19，它對血腦屏障的完整性至關(guān)重要。作者利用單細胞 RNA-seq 數(shù)據(jù)鑒定了 CD19 在腦壁細胞中的表達，并在蛋白水平上得到了證實。隨著壁細胞譜系的出現(xiàn)，大腦中 CD19 的表達在發(fā)育早期就開始了，并貫穿整個成年期的大腦區(qū)域。小鼠壁細胞顯示 CD19 表達水平較低，提示臨床前神經(jīng)毒性動物模型存在局限性。本研究揭示 CD19 靶向治療中神經(jīng)毒性的機制，并突出了人類單細胞圖譜在設(shè)計免疫療法中的應(yīng)用。

科學(xué)問題

CD19 靶向治療中神經(jīng)毒性的機制？

實驗設(shè)計

2364 人前額葉皮層細胞的 scRNA-seq 數(shù)據(jù)

實驗思路

實驗結(jié)果

單細胞 RNA 測序數(shù)據(jù)鑒定表達 CD19 的壁細胞

作者首先分析了 2364 人前額葉皮層細胞的 scRNA-seq 數(shù)據(jù)（Zhong 等人，2018 年），圖 1A)。作者將細胞聚集在一起，并確定了廣泛的群體，隨后重點分析了非神經(jīng)元、非紅細胞細胞。這些細胞進一步分化為星形膠質(zhì)細胞、淋巴細胞、小膠質(zhì)細胞、少突膠質(zhì)細胞前體、內(nèi)皮細胞和周細胞（圖 1B、1C 和 S1A)。根據(jù)表達標(biāo)記基因?qū)@些群體進行了鑒定；壁細胞特異表達預(yù)期的標(biāo)記基因，如 PDGFRB、FOXF2、RGS5 和 CD248，而內(nèi)皮細胞表達一組獨特的標(biāo)記基因，包括 CDH5 和 PECAM1?(CD31; 圖 1 ?d)。另外，發(fā)現(xiàn)一小群表達 CD19 的壁細胞（共同表達 CD248）。

▲圖 1

兩個獨立數(shù)據(jù)集對壁細胞 CD19 表達的確認(rèn)

接下來，作者試圖在額外的獨立 scRNA-seq 數(shù)據(jù)集中重現(xiàn)這一觀察結(jié)果。在來自人類前腦的數(shù)據(jù)集（La?Manno?et?al.，2018) 中，標(biāo)記 CD248 和 RGS5 陽性的壁細胞群（48/7906 細胞）也顯示 CD19 表達（12/48 細胞有可測量的 CD19)，B 細胞標(biāo)記 CD79A 缺失（圖 2A)。在來自人類前腦腹側(cè)（La?Manno?et?al.，2016) 的第三個數(shù)據(jù)集中，作者再次觀察到 CD248 陽性壁細胞群體中 CD19 的表達（195 個壁細胞 /1977 細胞，其中 25/195 有可測量的 CD19; 圖 2 ?b).

▲圖 2

人腦 CD19 的免疫組化

為了評估人類壁細胞中 CD19 蛋白的表達，作者使用臨床驗證的抗人 CD19 抗體（克隆 BT51E) 對健康死亡受試者的樣本進行了人類大腦幾個區(qū)域的免疫組化。研究發(fā)現(xiàn) CD19+ 壁細胞的頻率可能存在異質(zhì)性，這可以解釋臨床觀察到的神經(jīng)毒性在患者之間的嚴(yán)重程度差異（圖 3）。

▲圖 3

周細胞和 vSMCs 分析顯示 CD19 在壁細胞中表達。

通過分析周細胞和 vSMCs 的轉(zhuǎn)錄組，分析顯示，CD19 高度表達的神經(jīng)與血管的 meta-cell 集群，符合作者之前的結(jié)果（圖 4 ?c?D)。作者能夠清楚地區(qū)分未分化的祖細胞和分化的壁細胞，這表明一旦壁細胞出現(xiàn)，它們就會表達 CD19(圖 4E?F)。

▲圖 4

CD19 在周細胞和 vSMCs 中都有表達

作者使用來自 BICCN 數(shù)據(jù)集的細胞重復(fù)了這個分析，對非神經(jīng)元亞群（壁細胞、內(nèi)皮細胞和小膠質(zhì)細胞）進行重新分析和聚類，以區(qū)分 NVU 細胞類型的轉(zhuǎn)錄差異（圖 5A?B)。作者觀察到這些細胞顯示出強富集的周細胞標(biāo)志物，如 ABCC9 和 KCNJ8，不富集 ACTA2 或其他 vSMC 標(biāo)記基因，表明它們代表真實的周細胞（圖 5C)。另外發(fā)現(xiàn) CD19 也在 vSMC 群體中表達。這表明 CD19 的表達并非周細胞所特有，而是人類大腦壁細胞的共同特征，與 IHC 觀察到的染色模式一致（圖 3)。

▲圖 5

CAR- T 細胞識別的 CD19 亞型在成人人腦中表達

為了探究周細胞中的 CD19 表達是否也存在于成人樣本中，作者使用了 Allen?Institute?Brainspan?Project 生成的橫跨人類年齡和大腦區(qū)域的 ?RNA 測序數(shù)據(jù)。作者首先確認(rèn)了 CD19 在產(chǎn)前和產(chǎn)后樣本中表達水平相似，并且在不同腦區(qū)樣本中也有表達（圖 6A)。分析發(fā)現(xiàn) CD19 在成人大腦中的表達主要是壁細胞豐度的結(jié)果，而不是 B 細胞豐度的結(jié)果。

▲圖 6

人腦 CD19 的壁細胞特異性表達

研究對腦周細胞、肺周細胞和 vSMCs 進行了對比分析，作者發(fā)現(xiàn)了大腦和肺周細胞之間的許多轉(zhuǎn)錄差異（圖 7A,?S7A)。值得注意的是，CD19 在大腦中特異表達。作者探索了定位于細胞膜或細胞表面的基因是否在相對于肺周細胞和 B 細胞的 NVU 中有差異表達，并可用于提高 CD19?CAR- T 的安全性（圖 7B?C)。

▲圖 7

參考文獻：

Parker?Kevin?R,Migliorini?Denis,Perkey?Eric?et?al.?Single-Cell?Analyses?Identify?Brain?Mural?Cells?Expressing?CD19?as?Potential?Off-Tumor?Targets?for?CAR-T?Immunotherapies.[J]?.Cell,?2020,?183:?126-142.e17.