2020 年 11 月 26 日，Kiel University 在 Immunity（IF：21.5）上在線發(fā)表了一項(xiàng)研究，利用 14 名患者的多個(gè)外周血樣本分析了 bulk 轉(zhuǎn)錄組、bulk DNA 甲基化組和單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組。結(jié)果顯示重度 COVID-19 患者的特點(diǎn)是增殖、代謝增強(qiáng)的漿母細(xì)胞增加，同時(shí)研究人員還發(fā)現(xiàn) IFN 激活的循環(huán)巨核細(xì)胞擴(kuò)張，紅系生成增加，且具有缺氧信號(hào)的特征。巨核細(xì)胞和紅細(xì)胞衍生的共表達(dá)模式可能對(duì)疾病結(jié)果具有一定的預(yù)示功能。該研究表明 SARS-CoV- 2 感染影響了多種細(xì)胞的廣譜免疫功能。

1、實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

14 個(gè)住院的 COVID-19 患者的 5 個(gè)外周血樣本，作者采用了 scRNA-seq（10x Genomics），單細(xì)胞 B 細(xì)胞受體（BCR），RNA-seq、DNA 甲基化分析和多重細(xì)胞因子 ELISA 分析（圖 1A）。作者使用了經(jīng)過修改的 WHO 序數(shù)量表，該量表還考慮了幾種炎癥標(biāo)志物（血清 C 反應(yīng)蛋白 [CRP]，血清 IL- 6 和鐵蛋白），該分?jǐn)?shù)用于對(duì)患者的病程進(jìn)行分類（圖 1B 和 1C）。

圖 1 用于疾病軌跡分析的疾病階段的臨床定義

2、scRNA-seq 分析確定細(xì)胞分化軌跡

scRNA-seq 共得到 358,930 個(gè)細(xì)胞的數(shù)據(jù)，每個(gè)樣品平均有 10,900 個(gè)細(xì)胞；注釋得到 37 個(gè)不同的細(xì)胞亞群；聚類結(jié)果顯示單核細(xì)胞亞群中個(gè)體間的異質(zhì)性較高；跨時(shí)間點(diǎn)的計(jì)數(shù)揭示了幾種細(xì)胞類型的變化，包括單核細(xì)胞，增生性淋巴細(xì)胞和自然殺傷（NK）細(xì)胞，經(jīng)典 CD14 + 單核細(xì)胞的增加，尤其是在恢復(fù)期，而非經(jīng)典 CD16 + 單核細(xì)胞的數(shù)量在擬時(shí)序 2 和 3 都增加了，研究發(fā)現(xiàn) COVID-19 患者外周血中幾種源自骨髓的前體細(xì)胞類型的存在增加，并且在整個(gè)疾病過程中，巨核細(xì)胞（MK）比例明顯升高。

圖 2 沿?cái)M時(shí)序結(jié)果 UMAP 展示

3、 全血轉(zhuǎn)錄組特征沿 COVID-19 疾病軌跡動(dòng)態(tài)變化

接下來分析了 13 個(gè)住院患者的全血轉(zhuǎn)錄組學(xué)數(shù)據(jù)，從較多 5 個(gè)時(shí)間點(diǎn)開始與恢復(fù)對(duì)照進(jìn)行比較，并將特征與 14 個(gè)健康對(duì)照進(jìn)行比較。在健康對(duì)照和 COVID-19 患者之間，在對(duì)照與每種疾病軌跡假時(shí)的成對(duì)比較中，共有 5,915 個(gè)基因差異表達(dá)。與健康對(duì)照組相比，COVID-19 患者中大多數(shù)差異表達(dá)基因（DEG）的表達(dá)水平更高。早期變化包括免疫球蛋白轉(zhuǎn)錄本（IGHA1 和 IGHG1）和乳鐵蛋白（LTF）的增加，而編碼 Th17 特異性轉(zhuǎn)錄因子（TF）和 II 類 HLA 轉(zhuǎn)錄本的 RORC mRNA 水平在整個(gè)病程中均下降。IL-1β 和血管舒張信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)的基因在增量軌跡中（擬時(shí)序 1）高表達(dá)。從逐漸恢復(fù)到晚期恢復(fù)期（擬時(shí)序 1、3 和 4），編碼核糖體結(jié)構(gòu)蛋白的轉(zhuǎn)錄物大量減少，這可能反映了 I 型干擾素對(duì)蛋白合成裝置的普遍抑制。相反，在疾病活動(dòng)高峰期，與 IFN 相關(guān)的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物顯著增加，但是在關(guān)鍵疾病類別中卻受到抑制。通過構(gòu)建代謝模型，發(fā)現(xiàn)與康復(fù)和健康個(gè)體相比，炎性疾病狀態(tài)與更高數(shù)量的預(yù)測(cè)代謝活性途徑相關(guān)。

圖 3  COVID-19 中全血基因表達(dá)的動(dòng)力學(xué)

4、縱向共表達(dá)模塊可確定關(guān)鍵疾病中干擾素應(yīng)答的受損 以及血栓和紅細(xì)胞生成增加的特征

作者使用從成對(duì)和縱向分析（6,317 個(gè)基因）的組合中識(shí)別出的所有 DEG 進(jìn)行加權(quán)基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析。分析確定了共 10 個(gè)共表達(dá)基因的模塊，M1-M10，它們?cè)谡麄€(gè) COVID-19 疾病階段遵循不同的表達(dá)方式。評(píng)估模塊與 scRNA-seq 結(jié)果的細(xì)胞類型和臨床參數(shù)之間的個(gè)體相關(guān)性 C。在 scRNA-seq 數(shù)據(jù)上預(yù)測(cè)每個(gè)模塊的 hub 基因的表達(dá)，揭示了細(xì)胞類型和擬時(shí)序特異性表達(dá)模式?；蚣患治鼋沂玖嗣總€(gè)模塊中富集的生物學(xué)過程和途徑。

圖 4 差異表達(dá)基因的共表達(dá)分析和甲基化變化的整合

5、全血 DNA 甲基化分析揭示了與基因表達(dá)相關(guān)的 COVID-19 中的全基因組低甲基化

與健康對(duì)照進(jìn)行成對(duì)比較，在擬時(shí)序之間鑒定出 46,071 和 69,733 個(gè)差異甲基化的 CpG 位點(diǎn)，與健康對(duì)照相比，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)都存在大量的低甲基化位點(diǎn)。細(xì)胞反卷積分析鑒定出與 COVID-19 相關(guān)的 DNAm 基因的主要部分來自粒細(xì)胞，B 細(xì)胞，NK 細(xì)胞和單核細(xì)胞。

圖 5  COVID-19 的全基因組 DNA 甲基化

6、 整個(gè) COVID-19 疾病軌跡的成漿細(xì)胞和 B 細(xì)胞變化

將 scRNA-seq 數(shù)據(jù)中 22190 個(gè) B 細(xì)胞提取出來，將 B 細(xì)胞細(xì)分，其中包括 11509 個(gè)記憶 B 細(xì)胞，3993 個(gè) na?ve B 細(xì)胞，383 個(gè)過渡性 B 細(xì)胞和 6,295 PB 細(xì)胞。在 COVID-19 期間，PB 在很大程度上處于擴(kuò)張狀態(tài)，在高炎癥期處于高水平；富集分析發(fā)現(xiàn) PB 中代謝通路顯著富集。來自炎癥狀態(tài)的 PB 表現(xiàn)出較高的代謝活性，僅在恢復(fù)時(shí)才降低，而記憶和 na?ve B 細(xì)胞在疾病狀態(tài)之間的總體代謝活性上沒有顯示出顯著差異。PB 中增加的代謝過程是氧化磷酸化，乙醛酸和二羧酸酯代謝，NAD 合成以及各種氨基酸代謝途徑（包括甘氨酸，絲氨酸，丙氨酸，蘇氨酸，纈氨酸，亮氨酸和異亮氨酸）的增加。預(yù)計(jì)糖酵解在炎癥疾病階段具有低活性狀態(tài)，而在臨床恢復(fù)中則具有很高的活性（擬時(shí)序 6）。該分析確定了 PBs 的廣泛活化，并暗示了細(xì)胞向氨基酸代謝的強(qiáng)烈的免疫代謝轉(zhuǎn)變，這可能有助于重癥 COVID-19 中所見的免疫病理學(xué)。

圖 6 B 細(xì)胞亞群細(xì)分

7、 巨核細(xì)胞數(shù)量升高是 COVID-19 的全身炎癥反應(yīng)的特征

將 5,870 個(gè)巨核細(xì)胞分成兩個(gè)亞群，HSC 和 MEP，與健康對(duì)照組相比，恢復(fù)期的 HSC 和 MEP 顯著增加，在危重患者中觀察到偽編碼丙酮酸激酶的 PKM 轉(zhuǎn)錄量（PKM2）大量增加，并與 HIF1A 相互作用并促進(jìn)其活性（擬時(shí)序 2）。在這一組中，還存在高表達(dá)的 FCER1G，它編碼負(fù)責(zé)整合素（ITGA2-GP6）介導(dǎo)的血小板粘附的常見 FcRγ 鏈銜接子。盡管與健康對(duì)照組比較其水平低于 PBs，但是代謝建模確定了 MKs 沿疾病軌跡增加的代謝活性。預(yù)測(cè)過程與能量代謝（丙酮酸代謝，糖酵解和活性氧 [ROS] 解毒）顯著相關(guān)。

圖 7 巨核細(xì)胞水平升高是 COVID-19 的特征

文章提到細(xì)胞類型的 marker